leonard17

Category:

ДНК-микрочип

ДНК-микрочип (англ. DNA microarray)  — это сложная технология, используемая в молекулярной биологии и медицине. ДНК-микрочип представляет собой небольшую поверхность, на которую с большой плотностью в определённом порядке нанесены фрагменты одноцепочечной синтетической ДНК с известной последовательностью. Эти фрагменты выступают в роли зондов, с которыми гибридизуются (образуют двуцепочечные молекулы) комплементарные им цепи ДНК из исследуемого образца, обычно меченные флуоресцентным красителем. Чем больше в образце молекул ДНК с определенной последовательностью, тем большее их количество свяжется с комплементарным зондом, и тем сильнее будет оптический сигнал в точке микрочипа, куда был «посажен» соответствующий зонд. После гибридизации поверхность микрочипа сканируется, и в результате каждой последовательности ДНК ставится в соответствие тот или иной уровень сигнала, пропорциональный числу молекул ДНК с данной последовательностью, присутствующих в смеси.

В обычном ДНК микрочипе (н-р, производства Affymetrix) зонды прикрепляются к твердой поверхности — стеклянному или силиконовому чипу. Другие платформы, например, выпускаемые Illumina, используют микроскопические шарики вместо больших твердых поверхностей. Технология ДНК-микрочипов находит самые разнообразные применения в современной биологии и медицине для анализа сложных смесей ДНК — например, совокупности всех транскриптов (матричных РНК) в клетке. ДНК микрочипы используют для анализа изменения экспрессии генов, выявления однонуклеотидных полиморфизмов, генотипирования или повторного секвенирования мутантных геномов. Микрочипы отличаются по конструкции, особенностям работы, точности, эффективности и стоимости. 

Ниже приводится пример эксперимента с использованием ДНК-микрочипа. 

     Выделяются или выращиваются биологические образцы, которые необходимо сравнить. Они могут соответствовать одним и тем же индивидуумам до и после какого-либо лечения (случай парных сравнений), либо различным группам индивидуумов, например, больным и здоровым, и т. д.

    Из образца выделяется очищенная нуклеиновая кислота, являющаяся объектом исследования: это может быть РНК в исследовании профиля экспрессии генов, ДНК при изучении сравнительной геномной гибридизации и т.д. Данный пример соответствует первому случаю.

    Проверяется качество и количество полученной нуклеиновой кислоты. Если требования соблюдены, эксперимент может быть продолжен.

    На основе имеющихся образцов РНК в процессе обратной транскрипции синтезируются последовательности комплементарных ДНК (кДНК, англ. cDNA).

    В процессе амплификации (синтеза дополнительных копий ДНК) количество последовательностей кДНК в образцах многократно увеличивается.

    К концам последовательностей кДНК присоединяются флуоресцентные или радиоактивные метки.

    Полученные образцы в смеси с необходимыми химическими веществами через микроскопическое отверстие наносятся на ДНК-микрочипы и начинается процесс гибридизации, в ходе которого одна из цепей кДНК присоединяется к комплементарной ей цепи, имеющейся на микрочипе.

    После окончания процесса гибридизации чипы промываются для удаления остатков материала.

    Полученные микрочипы сканируются при помощи лазера. На выходе получается одно- или двухцветные изображения (в зависимости от количества использованных красителей).

    На каждое изображение накладывается сетка, так, что каждой её ячейке соответствует участок чипа с пробами одного типа. Интенсивности свечения проб в ячейке сетки ставится в соответствие некоторое число, которое, в самом первом приближении, может служить мерой количества присутствовавших последовательностей РНК в соответствующем образце. 

Дальнейшая обработка результатов требует многоэтапного привлечения сложного статистического аппарата. 

 Предобработка данных эксперимента

Корреляция между интенсивностями двух проб одного ДНК-микрочипа, представляющих один и тот же ген, обычно превышает 95%. Часто этот факт интерпретируют как подтверждение хорошей воспроизводимости экспериментов с чипами. Однако, если один и тот же биологические материал разделить на две части и сделать с ними разные микрочипы, корреляция между полученными интенсивностями, скорее всего, будет составлять от 60 до 80%. Корреляция на чипах с образцами, взятыми у мышей из одного помёта, может опускаться до 30%. Если эксперименты проводятся в разных лабораториях, корреляция между их результатами может быть ещё ниже

Такая низкая воспроизводимость интенсивностей связана с совокупным воздействием большого количества источников вариации. Их можно разделить на три большие группы. Биологическая вариация включает неотъемлемые особенности организмов. Техническая вариация появляется на этапе выделения образцов, их окрашивания и гибридизации. Погрешность измерения связана со сканированием готовых массивов, на результаты которого может повлиять, например, пыль внутри сканера.

Нейтрализация эффектов технической вариации и ошибки измерения производится на этапе предобработки ДНК-микрочипов.

Фоновая поправка

Необходимость фоновой поправки связана с наличием таких мешающих факторов, как шум оптической системы распознавания (данные интенсивности, полученные при сканировании, не равны "настоящим" интенсивностям проб) и неспецифическая гибридизация (присоединение нуклеотидных последовательностей к зондам чужих проб).

Нормализация

   Нормализация данных позволяет сделать несколько рассматриваемых в эксперименте чипов пригодными к сравнению между собой. Основная цель анализа на этом этапе - исключить влияние систематических небиологических различий между микрочипами. Источников таких различий множество: вариации эффективности обратной транскрипции, маркировки красителями, гибридизации, физические различия между чипами, небольшие различия в концентрации реагентов, вариация лабораторных условий.

Показано, что выбор метода нормализации оказывает существенное влияние на результат анализа




Error

default userpic

Your IP address will be recorded 

When you submit the form an invisible reCAPTCHA check will be performed.
You must follow the Privacy Policy and Google Terms of use.